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动物性产品中兽药残留的快速检测方法
2012/4/20 [4095]

 

动物性产品中兽药残留的快速检测方法
          —— ELISA & Charm
一、前言:
1、             现状
目前兽医用药几乎占据了所有抗微生物药物的50%,因此食品病原菌、条件致病菌和共生菌不可避免的成了耐药菌。在过去的50年中大约有100万吨的抗生素被释放到生物圈中。欧洲动物卫生联盟(European Federation of Animal Health ,FEDESA)对欧盟和瑞士抗生素使用统计数据表明,仅1997年用于人类健康的抗生素达5460吨,用于动物健康的抗生素达3465吨,用于动物生长促进剂的抗生素达1575吨,并有逐年增加的趋势。
在我国,由于兽医用药制度的不完善及一些养殖厂受经济利益的驱使及相应的检测监督体系不健全,药物的滥用现象更为严重,动物产品中兽药的污染时有发生。其潜在的致癌、致畸作用引起了社会的普遍关注,由于水产品中氯霉素含量过高,欧盟委员会于今年1月作出禁止中国动物源食品进口的协议,使得我国水产品对欧盟出口严重受挫,虽然现在部分产品开始解禁,但形式依然不容乐观;美国、日本等国也开始高度关注我国水产品的质量,并出台一系列相关政策,对我国出口动物性产品进行限制。在现代文明的世界,健康*的贸易法则将是关税、价格、质量所不可比拟的,政治上的友好往来无法替代经济贸易中的游戏规则。
2、食品中兽药残留对人类的危害
2.1耐药菌株的产生
抗生素使用和细菌耐药性永远是互相依存、互相制约的矛盾的两个方面,细菌耐药非正常增加,往往是抗生素的非正常使用的结果。早在1920-30年青霉素问世时,Dr Fleming就提出了青霉素的耐药性问题。随着时代的发展和各种新药的出现,耐药性菌株也接踵而至(即包括药物选择压力的结果也包括细菌自身的进化)。抗生素的副作用以及耐药菌株的存在将严重威胁着人类的健康,而且临床亚治疗水平的抗生素更容易促使抗性基因的转移,比如对动物进行低水平四环素治疗,其粪肠菌群由对四环素敏感逐渐变成抗四环素zui后发展成对其它药物也产生抗性。在长期的生活中,恰恰是人类和动物肠道的正常菌群成了耐药基因的储存库,并不断的将耐药基因转移给致病菌,并在人和动物中交叉传播,尤其是释放到环境中耐药菌的危害更为严重,可造成耐药基因的迅速转移。
2.2抗生素的毒副作用
残留在动物性食品中的抗生素被人们食用后,除了加速人体内耐药菌株的进化之外,抗生素本身的毒副作用往往威胁人类尤其是孕妇和婴儿的健康,这一点在过去往往很容易被忽视。
2.2.1氯霉素
主要由Streptomyces venezuelae产生,目前已能人工合成。它能抑制细菌蛋白质生物合成,其效应部位位于核糖体上,因而对大多数G+菌和G菌都有杀伤力。氯霉素的毒副作用较多,其常见的是再生障碍贫血、造血功能紊乱、灰婴综合征、肢体感觉和运动障碍及休克。虽然氯霉素在动物疾病防治上曾发挥过一定的作用,但由于氯霉素可以产生致命性的副作用,因此欧盟已经在畜牧、水产业生产中禁止使用。
2.2.2b-内酰胺
b-内酰胺类抗生素通过抑制细菌转肽酶的活性而干扰细胞壁肽聚糖的合成,安苄青霉素和青霉素G是该类zui常见的两种化合物,由Penicillium chrysogenum产生。它可以通过胎盘传给胎儿,也能通过乳腺进入乳中。zui常见的副作用是以皮肤出现红斑为主要症状的过敏反应以及胃肠道紊乱引起的腹泻、恶心和呕吐。
2.2.3四环素
包括Oxytetracycline (土霉素,OTC)tetracycline (四环素,TC) chlortetracycline (金霉素,CTC) doxycycline (强力霉素,DC)等。
2.2.4  b-兴奋剂
        为拟交感神经类药物,该类兴奋剂的受体为b2受体故得名。该类兴奋剂可以促使肌肉骨骼肌血管壁扩张、支气管和子宫平滑肌松弛。因而在兽医临床上b2兴奋剂被广泛用作支气管扩张药和子宫松弛药,同时也被非法用作动物营养再分配的促生长剂。副作用,如:焦躁、震颤、过敏、神智不清、食欲不振、恶心和呕吐等以及心悸、高血压、心律失常、心动过速等心血管症状,其中拟交感神经类物质在组织中的溢出均可导致组织坏死。
2.2.5雌激素
是一种人工合成的非固醇类雌激素,主要用于治疗妇科紊乱、乳房和前列腺恶性肿瘤,为一种致癌物质;在肝脏中代谢缓慢,zui终能随尿和粪便排出。副作用包括:水肿、引起性欲冲动、改变月经周期、乳房异常发育、肝功能改变、胃肠道紊乱、衰竭、头痛、皮肤红斑、风疹。对于雄性动物来说,大剂量的雌激素可以增加血管栓塞的危险。此外,雌激素还能引起子宫内膜增生,使患子宫癌的频率增加。大剂量使用雌激素还可以导致骨骼发育闭合,停止生长。也能促使生殖道变形,对于雄性动物能使精子变形以及呕吐等。
2.2.6氨基甙类抗生素
主要包括庆大霉素、链霉素、新霉素、卡那霉素等,为以氨基环醇和氨基糖相连成核糖单位的多价阳离子复合物。氨基甙类通过与细菌核糖体不可逆结合而干扰细菌蛋白质的合成,进而导致细胞膜塌陷。氨基甙类药物的主要副作用是对听觉器官和肾的毒性、过敏反应以及对神经肌肉的影响。其中,庆大霉素能引起肝功紊乱、外周和中枢神经炎(包括脑炎、呆滞、抽搐);链霉素能导致神经紊乱,包括视觉神经炎和外周神经炎,以及严重的皮炎、过敏等超敏感反应。
二、兽药残留的快速检测方法
目前国际上对抗生素和激素类药物残留的检测主要有仪器分析法(包括HPLC和GC-MS)和生物学快速检测法(如:ELISA、RIA、CharmⅡ等)。其中,仪器分析法既要求仪器设备具有相当高的精度,也要求技术人员具有一定的操作和分析技能。作为仪器分析法,其昂贵的价格和软件更新的缓慢以及操作上的烦琐限制了此法的推广;但由于检测的灵敏度可以达到ng水平,在一些国家大型实验室里仍作为检验的参考依据使用。生物学快速检测法由于其操作上的简便、快速以及达到ng水平的灵敏度等优点,以成为动物产品中兽药残留检测的一种重要手段。尤其是ELISA(酶联免疫吸附试验)和CharmⅡ,其操作上的简便、快速和强烈的信噪比、达到ng水平的灵敏度等优点,其缺陷在于该法会出现假阳性结果,但做为一种快速筛选方法备受技术人员的青睐,在检测部门有着广泛的应用前景。
1、ELISA检测
1.1 所需仪器设备
酶标仪:常用的有美国的bio-lab(百乐),Bio-Tex,芬兰Labsystem等,价格在5万人民币左右;
氮气吹干仪:美国 Organomatic Associates,2万左右;
洗板机(不一定要配置):与酶标仪相应,价格在3-4万人民币左右;
离心机:6000g/min,国产价格在5000左右;
均质器:德国IKA,人民币6000左右;(拍式均质器:1-2万)
移液器:单道:1550/件,多道:5000/件;
恒温培养箱:
固相萃取仪:
1.2常用ELISA试剂盒
英国朗道(RANDOX),德国拜发(r-Biopharm),德国Riedel-deHaen荷兰E-D,美国NEOGEN,意大利Tecna等。
1.3检测原理(竞争法)
1.3.1 抗原抗体的基本结构
1.3.2检测的基础是基于抗原抗体的胶体特性与极性基的吸附作用。抗体的蛋白质(免疫球蛋白),大多数抗原也是蛋白质,在水溶液中都具胶体特性,并带电荷,形成相对稳定的亲水胶体。同时抗原、抗体含有羧基、氨基及肽链等极性基团,当两者由于理化特性相吻合互相吸引而结合后,成为憎水胶体系统。抗原和抗体的相互吸引和结合是依靠下列各种分子间引力所促成:
库仑吸引力/静电引力,抗原和抗体分子相反电荷的氨基和羧基之间相互吸引而促成;
范德华引力,由于抗原和抗体分子的外层电子之间相互作用的扰动产生一种引力,引起分子吸引而发生结合,这种作用取决于分子的空间构型;
氢键结合作用,具-OH、-NH2、-COOH等亲水基团的抗体和相应的抗原接近时,可形成相对微弱和可逆的氢键桥梁,使得抗原抗体结合;
疏水作用,抗原抗体分子侧链上的某些氨基酸(如亮氨酸、颉氨酸及苯丙氨酸等)为疏水基团,当抗原抗体分子表面上的这些疏水基团密切接触时可排除水分子,在两者之间产生相互吸引力而发生结合。
1.3.3抗原抗体的结合具有:
 特异性:取决于抗原决定簇的数量、性质和立体构型;抗体Fab段的高变区和相应抗原决定簇的结合能力. 所以抗原抗体的种类质量直接影响结果
 可逆行: 结合仅是分子表面的结合,而非共价键的结合,具有相对稳定性但为可逆反应.一定条件下(低PH、冬融、高浓度盐等)所以缓冲液很重要
zui适比例性:两者量需具一定的量比关系才发生zui强的结合反应。所以抗原抗体的数量也是重要因素
反应具阶段性:受环境中电解质、温度、PH、等因素的影响。所以在ELISA实验时各种步骤一定要准确到位。
1.3.4以氯霉素为例:
酶标板包被针对兔IgG(氯霉素抗体)的羊抗体。加入氯霉素抗体,氯霉素酶标记物,氯霉素标准液或样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体结合位点,同时氯霉素抗体也与固定的羊抗体结合。没有结合的氯霉素酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质和发色剂加到板孔中并孵育。结合的氯霉素酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色产物。加终止液后使颜色由蓝变黄。用450nm判读,吸光度值与样品中氯霉素含量成反比。 大多数试剂盒包被的是二抗。
RONDOX的试剂盒是直接将氯霉素特异性抗体预包被酶标板上,当在酶标孔中加入样品和酶标记氯霉素后,样品中的氯霉素和酶标记氯霉素竞争抗体结合位点,洗涤后底物显色,加酸终止之后,颜色由蓝变黄。用450nm判读,颜色深度与样品中氯霉素含量成反比。
  不同的ELISA原理直接影响其检测下限、特异性及结果的计算。
1.4 样品的前处理
不同样品有其特定的前处理方法,主要有以下几种:
1.4.1有机物抽提法:(氯霉素)
利用药物在有机物中的溶解性,达到分离纯化的目的
样品均质         称量      乙晴和或乙酸乙酯抽提       离心      吹干
      异辛烷/氯仿或正己烷抽提     离心      取水相分析
1.4.2离子交换法(如:C18过柱法)(链霉素)
离子交换是利用一些带离子基团的物质,吸附交换带相反电荷的蛋白质,将蛋白质按所带电荷不同或量的差异分成不同的组分。
样品称量      溶解     上柱
C18柱平衡                 洗柱      吸柱干燥     洗提      吹干
缓冲液重悬      分析
1.4.3(免疫)亲和层析(雌激素)
   利用生物大分子的生物学特性而设计的层析分离技术,如利用抗原和抗体、酶和酶的抑制物或配体、激素和受体等之间的亲和力,在一定条件下,两者可紧密结合形成复合物,若将其中一者固定在载体上,则可从溶液中提取和分离相应的另一方,并达到很高的纯度。现有商品化生产,(方便,减少装柱等繁琐步骤)其操作步骤与上者相似,可以按照试剂盒提供的步骤进行。
1.5酶标免疫分析程序(室温20-240C条件下操作)
每一个盒中的试剂足够进行96个测量(包括标准测定孔),以E-D CAP检测试剂盒为例:
1)取出试剂盒恢复至室温,充分混均;
2)释缓冲液(以ddw)稀释备用(也可用磷酸盐缓冲液,但要);
3)洗缓冲液(以ddw)稀释备用,也可用PBST(磷酸盐土温—20缓冲液);
4)酶标记物的配制:按试剂盒说明配置、混均,2-8度阴暗处保存;
5)抗体的配制:按试剂盒说明配置、混均,2-8度阴暗处保存;
6)取足够的微空条,记录加样顺序;
7)a.吸取100微升稀释缓冲液A1A2(试剂空白),
b.吸取50微升稀释缓冲液到B1B2(零标准),
c.吸取50微升标准液到CH孔,
d.加50微升样品到其余孔;
8)加酶标记物和抗体到除A1A2的所有孔;
10)盖膜,震荡1分钟;
11)在一定条件下孵育;
12)洗板,一定要彻底充分,并且次数固定,推荐用洗板机(百乐);
13)加底物,室温培养(25度)孵育;
14)加终止液;
15450nm波长下读数。
1.6标准曲线的绘制
a.每个标准液或样品的OD值均要减去空白A1A2OD值,
b.标准液和样品的OD值除以零标准(B1B2)的OD
c. 绘制半对数曲线(以B/B0Y轴,标准样品浓度的对数为X轴),可用一些专业软件,也可用半对数纸或在EXCEL上绘制。
2、Charm检测
CHARM II 6600/7600分析仪是一台多功能、单样品的液体闪烁(LSC)和生物发光计数器。该法具有快速、简便的特点,但其假阳性率教高,适宜快速筛选
2.1仪器组成:
   Charm II 6600 / 7600分析仪
   Charm孵育器
   CentraCL2离心机
   均质器、移液器
2.2 检测原理
   微生物受体免疫分析法,属于免疫分析法的一种,其建立的基础是药物功能团与微生物受体位点的结合反应。在某些方面类似于放射免疫分析(RIA),所不同的是RIA使用抗体作为结合剂,而受体分析则是使用细菌细胞的固定位点当做特殊的结合剂。
    一个单一的细菌细胞含有可结合药物的特殊结合位点,药物和受体位点的结合反应离解常数低,因而具特异性和灵敏性。对于该法具体原理Charm公司未有详细深入的报道(商业方面考虑),主要是利用两种不同的细菌提供7大类抗生素结合的必须位点,药物的功能团与位点有关,不象免疫分析只涉及到侧链,一种微生物受体可结合一类药物的所有药物。
象ELISA类似,这种结合也是一种竞争结合。在试管中加入一定量的细菌(受体)、放射性标记药物和样品,样品中的药物和放射性标记药物竞争结合受体,未于受体位点结合的标记性药物在读数前被去掉,加入闪烁液,在分析仪上读数。
2.3检测的一般程序
2.3.1准备工作:首先按说明书配制好所需的提取缓冲液、M2缓冲液、阴性对照和阳性对照。
仪器零点测定:用空试管测定仪器的零点是否正常。
试剂和仪器有效性确认:检测阴性对照液和阳性对照液各3次,求出cpm值的平均值,与出厂的计数单对比,能在其±10%左右波动。如果与计数单相比偏移较大,试剂可能部分失效,但只要阳性平均值/阴性平均值小于0.7,试剂仍然可用,但灵敏度会有所降低。
控制点的确定:控制点是阴性结果与阳性结果的临界值。利用控制点来判断结果。有两种确定控制点的方法:根据样品的种类或检测水平选择适当的控制点确定方法。控制点确定方法有二。有些说明书上两种方法都列出,用户可根据需要选择,选第二种。
方法一:直接以阴性对照来确定控制点,一般样品干扰小或接近仪器的下限时,采用这种方法,只需再做3次,与前3次试剂性能确认的结果一起求平均值,然后减法X%,即为控制点。X为变数,由厂家用定量方法校准。
方法二:以空白加标样品来确定控制点。这种方法的关键是找到阴性样品,如果没有其它的定量方法找阴性样品,可根据阴性对照平均值来找阴性样品(阴性对照平均值±X%)。用此阴性样品,按检测水平和稀释倍数,加抗生素标准品,用此空白加标样品,测定6CPM值,求平均值,控制点=平均值*(120%)。
2.3.2测定实际样品
前处理:不同的样品具不同的前处理方法,一般尿样、血清、血浆等只需用缓冲液稀释即可,而组织样品则需均质、提取、孵育等过程,对于蜂蜜等一些样品则要过柱。总的来说,前处理要比ELISA更简便、快速。
按照操作说明检测结合试剂片加入试管;加入300微升水混均;加入处理过的样品;加入标记性药物,混合;孵育;离心,弃去上清液;加水混均;加闪烁液,混均;读数。
三、实验室分析质量控制
涉及仪器的校正、过程控制、标准物控制、环境、实验室管理(监控所进行的测试及记录结果,以便发现发展趋势,统计技术进行结果评审)
1、快速筛选方法及定性方法
选择性:检出目的物质的能力;
灵敏性:样品中检出这种药物真正阳性结果的比率;
准确性:所得值和真实值的一致性,用不确定度来衡量——重复多次测定值和真实值之差;
检测限:分析方法能从样品背景信号中检测出待检物质的zui低浓度;
重复性:
2、定量方法的附加要求
回收率:
定量限:分析方法能对样品中待检物质进行定量检测的zui低浓度,反映该方法在低浓度端分析结果的可靠性;
精密度:对同一样品重复测定,每次测定值和均值的接近程度,主要反映随机误差;
重复性:批内重复、批间重复线形范围:曲线的拟和
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